Validation of reproduction tests with molluscs : establishment of an OECD test guideline for the identification of endocrine and reproductive toxic effects in snails : final report / by Cornelia Geiß, Katharina Ruppert, Jörg Oehlmann (Goethe University Frankfurt am Main Institute for Ecology, Evolution and Diversity - Department Aquatic Ecotoxicology, Frankfurt am Main) ; on behalf of the German Environment Agency ; study performed by: Goethe University Frankfurt am Main, Institute for Ecology, Evolution and Diversity, Department Aquatic Ecotoxicology ; edited by: Section IV 2.2 Pharmaceuticals, Washing and Cleaning Agents Dr. Jean Bachmann

Abstract

Ziel des Projekts war die Entwicklung eines OECD-Prüfrichtlinien-Entwurfs für einen Reproduktionstest mit Potamopyrgus antipodarum, einschließlich der dafür notwendigen Validierungs- und Optimierungsarbeiten. Zusätzlich sollten experimentelle Arbeiten zur Entwicklung eines kompletten Lebenszyklustest durchgeführt und eine Standardarbeitsanweisung (SOP) erstellt werden. Weiterhin sollten im Rahmen der von Frankreich koordinierten Validierungsstudien zur Entwicklung eines Reproduktionstests mit Lymnaea stagnalis experimentelle Arbeiten durchgeführt werden. Die erarbeitete SOP des Reproduktionstests mit P. antipodarum wurde optimiert und validiert. In dem 28-tägigen Reproduktionstest werden Mortalität und die Zahl der Embryonen in der Bruttasche pro Weibchen als Endpunkte aufgenommen. Zur Optimierung der Zuchtbedingungen wurden verschiedene Testmedien sowie unterschiedliche Besatzdichten der Schnecken untersucht. Weiterhin wurde der Einfluss der Temperatur und der Photoperiode auf die Reproduktion von P. antipodarum über den Jahresverlauf ermittelt. Die Ergebnisse zeigen, dass optimale Zuchtbedingungen mit einer Temperatur von 16°C und einem Hell:Dunkel Rhythmus von 16:8 h erreicht werden können. Die Optimierung der Futterdosis im Reproduktionstest erleichtert die Bestimmung der Effekte von reproduktionstoxischen Substanzen und von Chemikalien, die zu einer Reproduktionssteigerung der Schnecken führen. Eine Unterversorgung oder Reduktion der Energiereserven der Schnecken wird dabei vermieden. Um das vorgeschlagene Testdesign zu validieren und mögliche Probleme bei der Durchführung des Reproduktionstests mit P. antipodarum gemäß SOP zu identifizieren, wurden drei Ringtests mit insgesamt 16 Partnern unter Koordination der Goethe-Universität durchgeführt. Für die Validierungsstudien wurden Cadmium, Tributylzinn, Prochloraz, Trenbolon, Triclocarban und Triclosan als Testsubstanzen ausgewählt. In den drei Ringtests erwies sich der Reproduktionstest als robust und reproduzierbar, weil die Mehrzahl der Partnerlabore vergleichbare NOEC-, LOEC-, EC 10- und EC 50-Werte mit überlappenden 95%-Konfidenzintervallen ermittelten. Zum Projektende wurde eine Entwurfsversion der Prüfrichtlinie des Reproduktionstests mit P. antipodarum bei der OECD eingereicht und soll im Juli 2015 zur öffentlichen Kommentierung bereitgestellt werden (siehe Anhang 8.3). Die Ergebnisse des Vorhabens tragen somit gezielt zur Weiterentwicklung von Testmethoden und Bewertungskonzepten für die Regulierung reproduktionstoxischer (z.B. endokrin wirksamer) Chemikalien in REACH, sowie von Pflanzenschutzmitteln, Arzneimitteln und Bioziden bei. Darüber hinaus wurden zwei mögliche Testdesigns für einen vollständigen Lebenszyklustest mit P. antipodarum entwickelt und deren Durchführbarkeit und Eignung evaluiert. Ein Entwurf für eine SOP des Lebenszyklustestes findet sich im Anhang 8.2.

The aim of the project was the development of an OECD draft test guideline for the reproduction test with Potamopyrgus antipodarum including the required validation and optimisation. Additionally, a full life cycle test with P. antipodarum should be developed and a standard operating procedure (SOP) should be compiled. Furthermore, to contribute to the validation studies of the reproduction test with Lymnaea stagnalis coordinated by France, experimental assistance should be performed. The existing SOP of the reproduction test with P. antipodarum has been optimised and validated. In the 28 days reproduction test the number of embryos in the brood pouch, reflecting the individual reproduction effort in snails, and adult mortality serve as endpoints. To optimise the culture conditions of the snails, different test media and snail densities were investigated. Also, the influence of temperature and photoperiod on the reproduction of P. antipodarum was studied during the course of the year. The results show that the optimum breeding conditions are at a temperature of 16°C and a light:dark regime of 16:8 h. An optimisation of the food dose during the test facilitates the assessment of both reproductive toxicants and substances enhancing reproduction without causing food limitation or influencing energy reserves of the snails. To validate the proposed test design and to identify issues in performing the SOP of the P. antipodarum reproduction test, three ring tests with 16 partners were performed coordinated by Goethe University. Within these ring trials cadmium, tributyltin, prochloraz, trenbolone, triclocarban and triclosan were chosen as test chemicals. For the three ring tests the robustness and the reproducibility of the reproduction test has been proven as most of the partner laboratories detected comparable NOEC, LOEC, EC 10 and EC50 values with overlapping 95%-confidence intervals for the latter. At the end of the project a draft test guideline for the reproduction test with P. antipodarum was submitted to OECD and will be made available for an international commenting round (see Annex 8.3). The outcome of the project contributes to the further development of test methods and evaluation concepts for the regulation of reproductive-toxic (e.g. endocrine active) chemicals in REACH, as well as pesticides, pharmaceuticals and biocides. Furthermore, to extend the reproduction test, two possible test designs for a full life cycle test with P. antipodarum were developed and the suitability of these test designs was evaluated. The draft SOP for full life cycle test with P. antipodarum can be found in annex 8.2.