EFF-Pharm : effects of pharmaceuticals (nonsteroidal anti-inflammatory drugs and beta-blockers) in fish and invertebrates and their detection by newly developed in vitro-bioassays / Rita Triebskorn, Simon Schwarz, Hannah Schmieg, Heinz-R. Köhler (University of Tübingen, Animal Physiological Ecology), Rita Triebskorn (Steinbeis Transfer Center for Ecotoxicology and Ecophysiology, Rottenburg), Dirk Jungmann, Kristin Berg, Anna Buchberger (GWT-TUD GmbH, Dresden), Manfred Frey (Steinbeis Innovation Center Cell Culture Technology, Mannheim), Marco Scheurer, Frank Sacher (DVGW Water Technology Center, Karlsruhe), Matthias Oetken, Jörg Oehlmann (University of Frankfurt, Aquatic Ecotoxicology) ; on behalf of the German Environment Agency ; study performed by: University of Tübingen ; edited by: Section IV 2.2 Pharmaceuticals, Washing and Cleaning Agents

Abstract

As tools for environmental monitoring of pharmaceuticals, mode of action (MOA)-based in vitro-assays were developed for beta-blockers, as e.g. metoprolol, and non-steroidal anti-inflammatory drugs (NSAIDs), as e.g. diclofenac. For this purpose stable cell lines were generated which expressed recombinant MOA-based sensing and reporting units allowing for rapid live-cell visualization of immediate fluorescence signal changes. Sensitive cell based assays developed in microtiter plate format facilitated the quantitative determination of metoprolol and diclofenac activities in effluents of wastewater treatment plants. In order to validate these tests for their suitability to reflect in vivo-effects in environmentally relevant aquatic organisms, toxicity tests and biomarker studies were conducted with fish (brown trout), crustaceans (gammarids, daphnia), snails and sediment-dwelling invertebrates (annelids). Test were conducted (1) in the laboratory under controlled experimental conditions with isolated substances and binary mixtures, (2) in aquatic mesocosms and (3) under field conditions in a bypass-system connected to the effluent of a municipal wastewater treatment plant. In addition to population relevant endpoints as e.g. reproduction, development or fertility, also individual health parameters were investigated by means of stress protein analyses, histological investigations and studies revealing the oxidative stress status of the exposed organisms.

Als Werkzeuge für das Biomonitoring von Arzneimitteln wurden Wirkmechanismus-basierte in vitro-Assays entwickelt, durch die der Nachweis von Wirkungen zweier Arzneimittelgruppen, entzündungshemmender Schmerzmittel, wie Diclofenac (NSAIDs) und Beta-Blocker, wie Metoprolol. möglich ist. Hierfür wurden stabile Zelllinien entwickelt, die Wirkmechanismus-basierte sensorische und signalgebende rekombinante Proteine exprimieren. Diese ermöglichen die schnelle Visualisierung von Fluoreszenzsignaländerungen in den lebenden Zellen. Darauf aufbauenden Mikroplattenformat-Assays wurden für die quantitative Bestimmung von Metoprolol- und Diclofenac-Aktivität in Kläranlagenabläufen erfolgreich eingesetzt. Um die Relevanz und Eignung dieser Tests zum Abbilden von Wirkungen bei Freiland-relevanten aquatischen Organismen zu zeigen, wurden parallel Wirkuntersuchungen mit Fischen (Bachforellen und deren Eier), Krebstieren (Flohkrebsen, Daphnien), Schnecken und mit im Sediment lebenden Würmern durchgeführt. Die Untersuchungen fanden (1) unter kontrollierten Laborbedingungen mit Einzelsubstanzen und binären Mischungen, (2) in aquatischen Mesokosmen (Fließrinnen) sowie im Freiland in einem Durchflusssystem, das vom Ablauf einer kommunalen Kläranlage gespeist war, statt. An den exponierten Organismen wurden sowohl populationsrelevante Endpunkte, wie Mortalität, Fruchtbarkeit oder Reproduktion, als auch Biomarker (Reaktionen von Stressproteinen und Parametern, die oxidativen Stress anzeigen sowie histologische Veränderungen) untersucht, die den Gesundheitsstatus der Individuen abbilden.